北京普利莱基因技术有限公司

主营产品：各种生化指标测定试剂盒、WB蛋白相关所有试剂、抗体、转染试剂、染色液

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普利莱 DOTAP真核细胞转染试剂货号: C1510-0.25（厂家直销批发）

价格	￥750/ml
起订量	≥1
所在地	北京辖区	可售量 10000ml

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基本参数

品牌	普利莱	产品品牌	APPLYGEN
产品名称	普利莱 DOTAP真核细胞转染试剂	英文名称	无
产品规格	0.25ml	储存	具体根据说明书操作
储存周期	根据说明书具体操作	供货能力	现货
可售卖地	全国	用途	科研实验专用
货号	C1510-0.25

普利莱 DOTAP真核细胞转染试剂货号: C1510-0.25

货号	产品名称	规格	价格
C1510	DOTAP 真核细胞转染试剂	0.25ml	750元
C1510	DOTAP 真核细胞转染试剂	0.5ml	1300元
C1510	DOTAP 真核细胞转染试剂	1ml	2300元

描述：

DOTAP是一种阳离子脂质体，可与DNA或RNA形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放入细胞内。它以可靠性和高效性著称，是广泛使用的商品化转染试剂。我们的DOTAP真核细胞转染试剂是由DOTAP和中性辅助脂质以特定比例融合制备而成的单层脂质体悬液。这种制备方法增加了脂质体对真核细胞转染的高效性、广谱性、低毒性和可靠性，并使试剂在4°C储存至少稳定12个月。DOTAP可高效转染多种细胞，甚至在低浓度血清环境也可工作良好。它属于可被生物降解的脂质体因而细胞毒性明显降低，其转染效率高于Sigma公司的DOTAP单体转染试剂，与Invitrogen的LipofectAMINE相当，但其价格仅相当同类试剂的1/3。

转染时只需将稀释的DOTAP试剂与DNA溶液混合并室温放置15分钟即可加入细胞。1mlDOTAP可转染100-500μgDNA或50-100只35mm培养皿或250-1000孔24孔板细胞。

颜色：

清亮或略呈白色胶体溶液。

储存：

4°C储存12个月。切勿冻存。

适用：

将DNA、RNA、寡聚核苷酸转入真核细胞。适用于大多数传代或原代细胞。

效果展示：

DOTAP真核细胞转染试剂(#C1510)LipofectAMINE

图：293细胞于24孔板中生长至75%满(confluency)，每孔细胞分别用DOTAP真核细胞转染试剂(#C1510)和Invitrogen公司的LipofectAMINE转染各0.5 μg pEGFP质粒。转染24小时后观察绿色GFP荧光。

转染步骤：

以生长于24孔板的一个孔内的贴壁细胞为例，使用其它规格培养皿参见表一。

细胞准备：

转染前一天传0.5-2 x 105细胞于24孔板内，加1 ml正常培养基培养。在光镜下观察细胞，当细胞群覆盖培养瓶皿生长表面的85-95%时，为DOTAP转染的最佳时机。这通常需要18-24小时，但依细胞类型和接种量而变。注意：传代时接种过多的细胞，100%长满的细胞的转化效率明显降低

制备转染复合物：

对特定细胞类型来说，应该优化加入DNA (μg)和DOTAP (μl)比率和绝对量，参见后面附表。推荐DNA和DOTAP的初始比例为1:4。DNA (μg)：DOTAP (μl)＝1:2～1:8

转染实际上是人为造成细胞对外源物质的高摄取状态，因此过量摄入DNA和转染试剂将导致细胞毒性而降低转染效率。与细胞接触的转染混合物中DOTAP的最大浓度不应超过30μl/ml，DNA浓度应小于5μg/ml。参考表一制备转染复合物，参照表二进行优化。下面的步骤以生长于24孔板的单孔贴壁细胞为例。悬浮细胞转染参见表一后面的说明。

1.取1μg DNA稀释到25μl无血清无抗生素培养基，混匀。

2.取2-8μl DOTAP加入到25μl无血清抗生素培养基，轻轻混匀。

3.吸取稀释的DNA溶液加入到稀释的DOTAP溶液中，上下吹吸混匀，勿振荡。室温孵育15分钟。

如果按照相反的顺序将稀释的DOTAP溶液与DNA混合，将生成相反类型的DNA转染复合物，有可能会导致转染效率下降。

4.在此期间用无血清培养基洗涤细胞1-2次，按照表一Step 5加入适宜体积的无血清无抗生素培养基。

5.加入步骤3获得的转染复合物于培养瓶皿内，轻轻混合与细胞充分接触，开始转染细胞。

6.二氧化碳孵箱37C孵育细胞4小时。

7.吸除转染混合物，加入含血清的正常培养基；或直接将含血清培养基加到孔内，继续培养24小时以上。观察细胞，进行下一步实验。或1:10稀释传代，进行G418筛选。

表一DNA和转染试剂稀释表

			Step 1	Step 2	Step 3	Step 4	Step 5
Culture Vessel	Area cm2	Cell No.	DiluteDNA (μg)tomedia (μl)	DiluteDOTAP (μl)tomedia (μl)	DOTAP: DNA mixture	Serum-free mediain well	TotalTrans.volume
96-well	0.3	1′104	0.2 μgin 10 μl	0.5μl in 10 μl	20 μl	80 μl	100 μl
48-well	1	5′104	0.5μgin 20 μl	2μl in 20 μl	40 μl	100 μl	140 μl
24-well	2	1′105	1μgin 50 μl	4μl in 50 μl	100 μl	200 μl	300 μl
12-well	4	2′105	2μgin 100 μl	8μl in 100 μl	200 μl	400 μl	600 μl
6-well	10	5′105	4μgin 250 μl	15μl in 250 μl	500 μl	1000 μl	1.5 ml
35-mm	10	5′105	4μgin 250 μl	15μl in 250 μl	500 μl	1000 μl	1.5 ml
60-mm	30	1′106	10μgin 500 μl	40μl in 500 μl	1000 μl	2000 μl	3 ml
10-cm	75	4′106	20μgin 1000 μl	60μl in 1000 μl	2000 μl	4000 μl	6 ml

悬浮细胞转染：

悬浮细胞转染与上述步骤类似：(1)离心收取细胞，用不含血清培养基洗涤2次；将1x 106细胞混悬于1ml无血清培养基，加入6孔板内。(2)按照表一制备转染复合物。将转染复合物加到悬浮细胞的培养基中，轻轻混匀。(3)二氧化碳孵箱培养4小时。(4)吸除转染混合物，换常规培养基，继续培养24小时以上。观察细胞或进行下一步实验如G418筛选。

转染优化程序：

对特定类型的细胞，欲获得最大转染效率和最低细胞毒性，应该对加入DNA和DOTAP的绝对量和比率、浓度等分别进行优化，步骤参见表二。表二是生长于24孔板的单孔细胞为例进行优化操作的。由于可以理解的心理因素，实验人员在转染时常常趋于加入过量的DNA和转染试剂和使用更小的转染复合物体积。从表二可以计算，如果每孔加入1μg DNA和8μl DOTAP，在200μl转染混合物中，DNA的浓度将为5μg/ml，DOTAP浓度达到40μl/ml，二者的浓度很容易产生细胞毒性；另外转染混合物体积很少时不利于操作也不利于细胞生长，不利于获得最佳转染效率。作为参考，通常最后的转染混合物中DNA浓度应小于5μg/ml，DOTAP浓度应30～40μl/ml。表二给出DNA和转染试剂的量、比率、浓度等指标仅作为参考。

表二转染优化操作程序

1.优化DNA:DOTAP比率，固定加入0.5μg DNA

DNA : DOTAP ratio 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

DNA μg in 25 μl 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

DOTAP μl in 25 μl 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Add media μl 150 150 150 150 150 150

Final volume μl 200 200 200 200 200 200

Final DNA concentration μg/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Final DOTAP concentration μl/ml 2.5 5 7.5 10 12.5 15

2.优化DNA和DOTAP绝对剂量，固定DNA:DOTAP比率为1:3或1:4

DNA : DOTAP ratio 1:3 1:3 1:3 1:3 1:3

DNA μg in 25 μl 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6