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北京普利莱基因技术有限公司
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主营产品: 各种生化指标测定试剂盒、WB蛋白相关所有试剂、抗体、转染试剂、染色液
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纯度 | 科研试剂 | 规格 | 100次 |
品牌 | 普利莱 | 型号 | 科研试剂 |
用途范围 | 实验研究 | 保质期 | -20℃避光保存,12个月 |
产品名称 | 组织细胞丙二醛(MDA)检测试剂盒 | 产品货号 | E2019 |
描述:组织细胞丙二醛(MDA)检测试剂盒是一种灵敏简单的检测脂质过氧化产物丙二醛的试剂盒。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物,一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物,通过检测MDA的水平可评价脂质氧化的水平,因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。
本试剂盒是一种基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)在较高温度和酸性环境中反应生成红色MDA-TBA加和物,MDA-TBA加和物在535nm波长具有最大吸收,据此可以通过比色法进行检测。另外MDA-TBA受535nm波长激发光激发,在553nm波长发出荧光,因此,可以通过荧光法检测MDA浓度。荧光法相对比色法灵敏度提高一个数量级。
反应示意图如下:
试剂盒以比色法检测线性范围为1.56-50μM,灵敏度≤1.56μM;荧光法检测线性范围为0.156-5μM,灵敏度≤0.156μM
适用:本试剂盒能够检测动物组织、培养细胞等样本中MDA含量。
组成:
组份名称 |
规格 |
数量 |
组织细胞裂解液 |
50ml |
1 |
MDA标准品(1mM) |
200μl/管 |
1 |
TBA |
50mg/管 |
1 |
TBA配制液 |
7.5ml/瓶 |
1 |
SDS溶液 |
12ml/瓶 |
1 |
BHT溶液(100×) |
1ml/管 |
1 |
储存条件:-20℃储存,一年有效。TBA配制成溶液后,可4℃避光储存一周。SDS溶液使用前,请恢复至室温并彻底溶解后使用,首次使用后4℃储存即可。
需要而未提供的试剂及器材
1. 超纯水
2. 0.1M PBS(PH7.0-7.4)和EDTA
3. 系列可调节量程移液器及吸头
4. 干净的试管、离心管及96孔板
5. 酶标仪
操作步骤:
1.样品的准备
1.1 细胞样品的准备:收集约2×106~2×107个新鲜细胞,PBS洗涤细胞一次,离心收集细胞,吸尽上清加入300 μl的中等强度RIPA裂解液(提前加入100×的抗氧化剂BHT)冰浴裂解30分钟。4℃,10000g离心10分钟。取上清用于MDA定量测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。对于细胞量差别大的样本请利用BCA蛋白定量法测定细胞裂解液上清中总蛋白浓度,以校正MDA测定结果。
1.2 组织样品的准备:利用含1mMEDTA的PBS灌流或漂洗组织,去除组织中的血液,然后取约10mg组织,加入500μl的中等强度RIPA裂解液(提前加入100×的抗氧化剂BHT),冰浴匀浆。4℃,10000g离心10分钟。取上清用于MDA定量测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。另外请利用BCA蛋白定量法测定组织裂解液上清中总蛋白浓度,以校正MDA测定结果。
2.试剂盒的准备
2.1 TBA溶液的配制:将本试剂盒提供的1管50 mgTBA倒入50ml离心管中,再加入7.5mlTBA配置震荡2分钟溶解TBA,然后加入17.5ml的纯水,彻底溶解TBA,可以超声助溶,即为TBA溶液,浓度为2mg/ml。
3. 标准品的准备
比色法标准品的配制:在1.5ml离心管中,加入950μl纯水,再取50μl的1mM浓度MDA标准品加入离心管中配制50μM浓度MDA标准品;然后取另外5根1.5ml离心管,分别加入500μl纯水,再吸取500μl的50μM浓度MDA标准品依次倍倍稀释为25、12.5、6.25、3.12、1.56μM浓度。
荧光法标准品的配制:在1.5ml离心管中,加入1ml纯水,再取5μl的1mM浓度MDA标准品加入离心管中配制5μM浓度MDA标准品;然后取另外5根1.5ml离心管,分别加入500μl纯水,再将500μl的5μM浓度MDA标准品依次倍倍稀释为2.5、1.25、0.625、0.312、0.156μM浓度。
测定方法
1.在1.5 ml离心管中,按下表进行配制:
空白管 |
标准品管 |
样品管 |
对照管 |
|
纯水 |
100μl |
200μl |
||
标准品 |
100μl |
|||
待测样品 |
100μl |
100μl |
||
SDS溶液 |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
TBA溶液 |
200μl |
200μl |
200μl |
一般情况下,对照管每批只需做1-2支,若样本不存在溶血、脂血现象,对照管可以不做。
2.将离心管置于95℃水浴或金属浴反应30分钟,然后冰浴冷却至室温。
3.10000g离心10min,取200μl上清溶液,测定吸光度(535nm)或发射的荧光强度(ex535nm-em553nm)。
数据处理
利用MDA标准品浓度为横坐标,吸光度值或发射荧光值为纵坐标制作标准曲线,并获得横纵坐标之间的函数关系式,然后利用标准曲线和各样品的吸光度值或发射荧光值计算样品的MDA浓度。细胞裂解上清和组织匀浆上清,可以计算每毫克蛋白中的MDA量MDA标曲测定结果如下图所示:
参考文献
1.Armstrong, D., and Browne, R. (1994). Free Radicals in Diagnostic Medicine. 366: 43-58.
2. Armstrong, D., et al. (1998). Free Radicals and Antioxidant Protocols. 108:315-324.
3. Yagi, K. (1998). Free Radicals and Antioxidant Protocols. 108: 101-106.
注意事项
1. 血红蛋白对测定有一定干扰,请尽量避免血浆和血清制备过程中的溶血。
2. TBA配制成溶液后不够稳定,要在4℃避光储存,一周内用完。
3. 初次使用试剂盒时,粉末试剂和小体积液体试剂请适当离心后使用。
4. 本产品仅限专业人员用于科学研究,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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