Ni-IDA 琼脂糖凝胶FF
价格 | ¥750/瓶 | |
起订量 | ≥1 | |
所在地 | 江苏 苏州 | 可售量 10000瓶 |
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苏州凯发新材料科技有限公司
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主营产品: MOF、黑磷、石墨炔、纳米酶、多层风琴状
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进入店铺货号 | CAS号 | 编号 | 包装 | 参数 | 库存 | 补货期 | 价格 |
BK-NRPB07L-10 | CAS | BK-NRPB07L | 10mL | 100 | 750 | ||
BK-NRPB07L-20 | CAS | BK-NRPB07L | 20mL | 100 | 1380 | ||
BK-NRPB07L-100 | CAS | BK-NRPB07L | 100mL | 100 | 5550 |
相关介绍:
镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质,通过活化偶联亚氨基二乙酸(IDA),再螯合Ni2 。其中IDA是金属螯合层析中最常用的配体,与次氮基三乙酸(NTA)相比,具有亲和力强,载量高,可再生重复使用的特点。
镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签(His-Tag)的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Ni2 形成稳定的配位键,因此能特异、牢固、可逆地吸附于固定这些金属离子的基质,结合了His-Tag重组蛋白的镍-琼脂糖凝胶FF一般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱。
技术指标:
基质 |
4%琼脂糖凝胶 |
配基 |
-N(CH2COOH)2 |
配基密度 |
≥25 μmol/ml |
填料粒径 |
60~180 μm |
最大流速 |
800 cm/h |
推荐流速 |
50~100 cm/h |
pH稳定性 |
pH 5~12,pH 3~14(脱镍) |
耐反压 |
0.3 MPa |
载量 |
≥40 mg His-tag重组蛋白/ml |
使用方法:
1.色谱柱装填
1.1 所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一至,液体最好做脱气处理。
1.2 在柱子下端加入蒸馏水,以除去柱子中的空气,关闭柱子出口,在柱内保留少量的蒸馏水。
1.3 将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时,要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流,以减少气泡的产生,让填料先自然沉降。
1.4 柱压不超过0.3 MPa,如果装柱系统中无法测柱压,则控制流速高于300 cm/h,但是在使用中一般只用最大流速的75%。
1.5填装好的镍-琼脂糖凝胶FF柱用2 ~ 5个柱体积的初始缓冲溶液平衡,建议流速100 cm/h,平衡后的柱子可以用于His-Tag重组蛋白的上样和洗脱纯化。
2.上样
2.1 样品一般溶解在pH6 ~ 8的初始缓冲液中,提高上样缓冲液的pH值,可以增大载量。
2.2 缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐,也最好不含巯基乙醇、DTT等还原剂。
2.3常用缓冲液有10 ~ 100 mM 磷酸钠缓冲液、20 ~ 200 mM Tris-HCl缓冲液等。
2.4在缓冲液中一般要加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl,以消除离子交换作用。
2.5在初次使用镍-琼脂糖凝胶FF,推荐使用50 mM PBS(50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,NaOH调节pH 7.4)作为初始缓冲液。
3. 洗脱
3.1 镍-琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。
3.2咪唑为碱性,相应缓冲液配制后需要用HCl进行调节pH。
3.3在初次使用镍-琼脂糖凝胶FF,不知道洗脱的咪唑浓度,推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑,浓度从低到高,分别洗脱和收集,通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定。
3.4 有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗脱,确定较佳洗脱条件。
拓展应用:
1. 更换不同的螯合离子
1.1 IDA螯合的镍-琼脂糖凝胶FF可以用EDTA脱掉镍,脱掉镍后可以用0.1 ~ 1.0M NaOH进行清洗凝胶,再重新螯合镍,使凝胶焕然一新。也可以螯合其他金属离子,如Cu2 ,Zn2 ,Co2 ,Fe3 等,进行多样纯化。
1.2 脱镍方法:用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子,再用5 ~ 10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子,再用2 ~ 3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。
1.3螯合金属离子方法:用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子,用0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属,螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗,去除未螯合的金属离子。
1.4 金属盐可以为硫酸盐或盐酸盐,如为NiSO4、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、PbSO4等,金属盐溶液应中性或弱酸性,且必须经过过滤,以防止金属盐在胶上沉淀。
1.5 如果是Fe3 必须在低pH下螯合(pH 3),以防止Fe3 产生沉淀,一般可以加入少量盐酸和硫酸保持pH。
2. 多种洗脱方法
2.1 降低pH洗脱:大多数蛋白在pH 4 ~ 6会被洗脱下来,也可以在pH 3 ~ 4,缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸或磷酸盐缓冲体系。
2.2 竞争性洗脱:线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质,如0 ~ 0.5 M咪唑,0 ~ 50 mM组氨酸,0 ~ 2 M NH4Cl。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH下进行。
2.3 螯合剂洗脱:EDTA、EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用力,导致蛋白被洗脱下来。这种方法不能使不同的蛋白分离,此外会影响蛋白吸附,导致融合蛋白不能挂柱。
2.4 所有上述情况中,缓冲液中必须加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl 以消除离子交换作用。
2.5 当螯合离子配基是Cu2 时,有以下的三种操作方式。
降低pH洗脱:
上样缓冲液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4
洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 3.5
竞争性洗脱:
上样缓冲液:50 mM NaH2PO4,1 M NaCl,pH 7.4
洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,1 M NH4Cl,pH 7.4
螯合剂洗脱:
上样缓冲液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4
洗脱缓冲液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,50 mM EDTA,pH 7.4
注:配制的缓冲液需要用NaOH或HCl调节至要求的pH。使用降低pH和螯合剂洗脱会使金属离子脱落,下次使用得重新螯和金属离子,最常用的为竞争性洗脱。
再生、清洗:
1. 凝胶的再生
1.1 多次使用后或需要更换螯合的金属离子,必须将胶脱镍再生。脱镍方法:用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子,再用5 ~ 10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子,再用2 ~ 3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。
1.2 多次使用的柱子脱镍后一般需要清洗。清洗方法:用0.1 ~ 1.0 M NaOH反向清洗柱子,流速50 cm/h,保持1 ~ 2 h,能去除结合强的杂质,同时也能去除热源。
1.3 清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法:用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子,用0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属,螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗,去除未螯合的金属离子。
2.在位清洗
2.1 除去因离子交换作用吸附的蛋白,用2 ~ 3个柱体积2 M 的NaCl溶液反向清洗柱子。
2.2 除去强的疏水性蛋白和脂质等,用4个柱体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇反向清洗柱子。
2.3 除去蛋白沉淀、疏水性蛋白,参照凝胶的再生。
注意事项:
推荐流速 |
|||
预装柱体积 |
1 ml |
5 ml |
10 ml |
流速(ml /min) |
0.2 |
1 |
2 |
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