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果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase,FBP)
试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
果糖-1,6-二磷酸酶又称果糖 1,6-二磷酸酯酶,催化 1,6-二磷酸果糖和水生成6-磷酸果糖和无机磷,在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。
测定原理
FBP催化 1,6-二磷酸果糖和水生成 6-磷酸果糖和无机磷,在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算FBP活性。
需自备的仪器和用品
分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入20mL试剂四充分溶解待用,用不完的试剂 4℃保存;
试剂二:液体×1 支,4℃保存;临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂4℃保存;
试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂 4℃保存;
试剂四:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;
样本的前处理
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、将试剂一、二、三 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热10分钟。
3、加样表:
试剂名称(μL) |
测定管 |
样本 |
20 |
试剂二 |
10 |
试剂三 |
10 |
试剂一 |
160 |
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿或96孔板中,立即混匀,加入最后一个试剂的同时开始计时,在340nm波长下记录反应1min后吸光度A1和反应 6min 后的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
FBP 活性计算
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T
=321.5×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T
=321.5×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T
=0.643×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=643×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T
=643×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
FBP(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T
=1.286×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:
反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
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