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进口牛血清使用方法

在细胞培养过程中，经常加入5%-20%的胎牛血清，最常使用的Bovogen胎牛血清浓度是10%。高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果，我们在实验中使用10%的Bovogen澳洲胎牛血清培养293T细胞，效果非常好。但是有些细胞也会使用5%的Bovogen FBS或者20%的Bovogen胎牛血清，要根据具体 细胞选择合适的Bovogen胎牛血清浓度。

进口胎牛血清FBS保存方法

1、需要长期保存的血清必须储存于-20℃ - 70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。切勿将血清在 37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会被破坏，而影响血清质量。如果一次无法用完一瓶,可 将40～45ml分装于无菌50ml离心管中。由于血清结冰时体积会增加约10%,因此,血清在冻入低温冰箱前，必须预留一 定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

2、一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接 过滤血清。

3、瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室温,待全 部溶解后再分装,一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度 与成分均一,减少沈淀的发生。.切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而 出现沉淀。

4、热灭活是指56℃, 30分钟加热已完全解冻的血清.加热过程中须规则摇晃均匀.此热处理的目的是使血清中的补体 成分灭活.除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量.补体 参与反应有:细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞 发生化学趋化和活化。

5、血清中的沉淀物 絮状物:主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身 的质量.可用离心3000rpm,5分钟去除,也可不用处理。 显微镜下"小黑点":经过热处理过的血清,沉淀物 的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象"小黑点",常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑 点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。

使用中遇到的常见问题总结

一、血清灭活问题。

 

1、问：加到培养基中的血清必须灭活吗？

 

答：不是必须的，看做什么实验了。

 

2、问：胎牛血清灭活是56℃ 30分钟吗？

 

答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。 但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

 

3、问：我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗？

 

答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。

 

4、问：我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗？因为血清中可能有些补体和抗体，是不是会影 响转染？我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗？细胞是单核细胞白血病细胞， 病毒是病毒包装细胞PT67收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么？

 

答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主 结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活 ！这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。

 

5、问：(1)我买的是Bovogen北美胎牛血清，要灭活吗？有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培 养基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有关系吗？

 

答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为 常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处 理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响。

 

我在实验室处理血清的时候，有一次水浴箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80℃，血清变成了凝胶状 ，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以 上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热 灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到 底有没有污染，常常又会把血清放置37℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验 ，和革兰氏染色试验，非常麻烦。

 

我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间， 而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高 ，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效 性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5) 的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3， Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没 有明显的促进作用。

 

你可以摸索一下，血清从-20℃冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活 ，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑 血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。

 

问：(2)分装后的美胎牛血清（胎牛血清南美）从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗？

 

答：正常。

 

二、血清的保存问题。

 

1、问：2016年6月到期胎牛血清到2017年5月还能用吗？

 

答：只有试试了，如果一直在-20℃冻着来者，应该还可以，先少用点看看。养细胞系应该没问题，原代不 行。

 

2、问：请问我自然溶化好的胎牛血清和1640培养基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室温下 一晚行吗？100毫升培养瓶加多少培养基呢？

 

答：可以放4℃。4-5ml。

 

3、问：4℃冰箱内保存3个月的胎牛血清，能否继续使用？相关细胞和其它试剂的代价比较高，不敢轻易尝 试。

 

答：需要长期保存血清必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中，4℃冰箱中保存时间不要超过1 个月。

 

三、血清灭活时温度问题。

 

1、问：因为实验室水浴锅失控，血清灭活时，温度到了61.7℃，这血清还能用吗？

 

答：多长时间啊？短时间应该可以吧，我有一次加热了一个多小时，还照样用。

 

2、问：我灭活胎牛血清时，用的电磁炉，定在了70℃，本来说调温度到56℃再放血清的，后来忘了，就把 血清放进去了，所以灭活的温度肯定超过56℃了，不知道这样对血清有没有影响？

 

答：常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等，其中最常用的手法是56℃ 热处理30分钟。看看你养的细胞是什么，一般的话估计问题不大，要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是 为了去除血清中补体等对热敏感的物质， 在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作 用。现在好像不主张热灭活，热灭活经常给血清产品带来负面影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，此外 ，有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

 

四、FBS可否代替人AB型血清？

 

问：我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养，文献上要求用人的AB型血清，但是我觉得很多代理商都没有 。我想FBS代替，但不知道可否，我先是担心免疫排斥之类，但是我查了些资料后，应该不会(我觉得)。但是我又不 能够TRY。因为细胞因子确实太贵了，所以咨询一下。谢谢！

 

答：你最好照文献的做。除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂) 。细胞培养的影响因素很多，特别是培养基的成分。

 

五、血清的制备方法问题。

 

1、问：我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞，有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备 过程？

 

答：自己制备血清当心污染啊。如果无菌条件好的话，用静置析出方法就行。

 

2、问：一般我们用得胎牛血清用前还要灭活，我想用大鼠的血，不知道要不要灭活？

 

答：你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜，离心，取上清，在无菌过滤，也可灭活，然后分装冻存，用 时再配。

 

3、问：如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤？

 

答：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺， 激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。灭活 一般不会对血清中的一些因子损伤的。

 

六、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

 

1、问：在进行心肌细胞原代培养时，需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清 10%的培养液，但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的，想问一下，1%的是否可 以，效果是否有保证？这样确实能节省不少血清的。

 

答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

 

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。 10%的FBS完全 培养基效果都不太好，开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右，但这就有出现另一个问题，在FBS完全培 养基中，成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长，纯化心肌细胞。

 

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用 。

 

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用，有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的 DMEM/F-12培养基培养。

 

2、问：我胰酶的用量是0.08% ，并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊， 难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗，还有，我的BRDU只用到48小时就不用了，因为担心其损伤太大，可以持续 用多久呢？

 

答：我用10%FBS终止的，然后差速1h，然后还是用10%FBS的HG-dmem养的，没有用brdu，心肌细胞还是比 较多和稳定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就会有搏动。

 

七、血清和培养基的种类及品牌问题。

 

1、问：细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢？周围有人用PAA或Hyclone的，这两种跟Gibco或 Bovogen出品的差别大吗？

 

答：如果是长得非常快得细胞如pa317，293，c6等恶性肿瘤细胞，一般得国产血清就可以，如果是原代培 养的细胞，最好应用胎牛血清或类标准胎牛血清，Hyclone公司血清的质量不如GIBCO(同类血清)。国产的杭州四季 青和甘肃民海（中美和资）不错。有些细胞(如：sf9，293还有其他一些元代细胞)，用Gibco的比其他两种好很多， 会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的 还要看产地。

 

2、问：最近要订一瓶Bovogen澳洲胎牛血清，实验室之前都在用小牛血清，没有买过Bovogen胎牛血清澳洲。请问哪个公司的好一些 ？问过试剂公司，有两种：一种是PAA的(分普通级和优级)，一种是Hyclone的(只有普通级，而且是新西兰产的)。 试剂公司推荐使用PAA优级的，但看好多文献都用Hyclone的，公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请 问用的哪种胎牛血清比较好？

 

答：民海的效果还不错，要是不放心国产的，那就买进口的。进口的好多公司都有，新西兰产的效果一般 。Hyclone和Gibco的都还可以。民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错。

 

3、问：四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别 ？培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些？

 

答：用无支原体胎牛血清就可以啦。

 

4、问：SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清？

 

答：我一直用GIBCO的1640，你可以买含HEPES的1*10L的包装，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。请查 阅： www.atcc.org

 

八、牛血清污染噬菌体的问题。

 

1、问：有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染，以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够 除去噬菌体？

 

2、问：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌体，它对细胞培养到底有什么影响？

 

暂无回答。

 

九、培养基血清浓度问题。

 

问：在1640里加血清时加多了，90ml里加了20ml血清，约为18%，以前都是加10ml的，查了网上多建议用 10%-15%，有关系吗？

 

答：我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大，建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大 当然细胞状态感觉要好，但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟 癌细胞很好。

 

十、问：MTT加药的时候加不加血清？加药时要用无血清的培养基吗？

 

答：我的药就是用含血清的培养基稀释的，不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用，无形中对细胞造 了一个serum-free的模型，细胞在提内本来就是有血清供应，如果该药物都不能对抗，那该药物就没有什么临床价 值了，这是我的理解。